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Visium空间基因表达解决方案的这些知识点，你Get到了吗？
人阅读 发布时间：2020-08-14 17:53
前段时间小编为大家介绍了Visium空间基因表达解决方案-冰冻切片制备指南和Visium空间基因表达解决方案-样本冰冻包埋指南；做为本年度最火的弯道超车技术之一，它将以全新的视角，带您还原基因表达的空间信息！虽然疫情对科研工作者的工作有影响，但是丝毫不影响大家的科研热情，老师们对空间转录组的关注也是与日俱增，这不，小编最近整理了一些老师们经常会问到的关于Visium的问题，现在，把答案分享给大家，记得收藏哦！
首先我们先回顾一下Visium空间基因表达解决方案的工作流程，然后我们针对每一步老师经常问到的问题进行解答。
组织优化
1.在Visium方案中，不同的样本类型透化的时间不同吗？
由于不同样本类型的组织密度和细胞外基质有所不同，所以其透化时间可能会不一样。因此我们建议对每种样本类型都需要进行组织优化实验，以确定最佳的透化时间。
2.在Visium方案中，组织优化玻片有八个捕获区域，如果有的捕获区域本次没有使用，可否下次重复使用呢？
无论您在处理过程中是否使用了所有捕获区域，玻片仅供一次性使用。这是因为流程中包含了多个步骤，包括对玻片进行染色、冲洗和重新干燥，这些步骤会破坏未使用的捕获区域上的寡核苷酸条形码，并降低其整体的灵敏度。同理，空间基因表达玻片有四个捕获区域，也只能是一次使用！
样本制备
1.组织在液氮中速冻可以做Visium吗？
不可以。组织不能直接置于液氮中，因为温差可能导致组织表面沸腾，从而引起组织鼓泡和不均匀冻结。这可能会造成组织破裂和形态损伤。因此，我们建议先将盛有异戊-烷的容器在液氮中预冷，然后将组织放到预冷的盛有异戊-烷的容器中，速冻。
2.福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织是否与Visium兼容？
现阶段只有包埋在OCT中的新鲜冷冻组织经过了Visium空间基因表达解决方案的验证。10x Genomics的研发团队成员正在积极研究FFPE组织相关的应用，并且已经获得一些初步结果，预计在2021年会推出适用于FFPE组织的实验方案。
3.Visium玻片组织切片厚度是多少？
Visium空间基因表达玻片的切片厚度取决于组织类型。例如，脂肪组织通常需要较厚的切片。建议客户尝试在其组织类型的最小建议厚度下获得高质量的切片。我们内部对5-35 µm的切片都进行了测试，而大多数类型的组织都使用10 µm的切片。同样值得注意的是，组织优化与空间基因表达玻片之间的组织厚度应当保持一致，因为组织厚度的变化可能导致透化效果不佳。
4.如何运输贴有组织切片的Visium玻片？
将组织切片贴在Visium玻片上后，可以在-80℃下保存最多7天，安排玻片运输时应考虑到时效性。为了运送贴有组织切片的Visium玻片，您应该遵循以下步骤。
①将包含组织的玻片放到预冷的玻片邮寄盒或50 ml离心管中，放在干冰上。如果要运送多张玻片，请将每张玻片放在单独的玻片邮寄盒或50 ml离心管中并尽量保持干燥。
②将玻片邮寄盒或离心管在干冰上放到塑料袋中，以确保将其完全密封。
③运输过程保证包裹加够足量干冰。
④收到包裹后，将玻片在干冰上运到-80℃进行存储，直至开始实验前。
5. 在样品制备和玻片处理过程中如何避免mRNA降解？
在优化实验前，会先对组织进行RNA RIN值检测，在保证RNA的完整性的前提下，在Visium工作流程中未观察到明显的mRNA降解。我们已经发现，尽管在室温下进行所有染色和漂洗步骤，我们的固定组织还是稳定的。我们建议您在处理RNA时遵循常规的best practices（在开始前用RNase Away净化工作台和移液器等），并在继续进行基因表达玻片之前检查组织优化玻片是否信号良好。
成像
1.成像测试玻片的作用是什么？
Visium配件试剂盒中提供的成像测试玻片有三个作用。
①确定客户的成像系统是否与Visium的实验要求兼容，并提供芯片辅助安装工具。
②提供PCR辅助工具，使得玻片可以在PCR上兼容。
③磁力架，用于空间转录组文库构建。
2.苏木-精和伊红染色（H＆E）成像是否需要彩色相机，还是可以使用单色相机？
我们建议使用彩色相机对H＆E染色的组织切片进行成像，使用单色相机时很难看清组织形态。根据我们的实验经验，Leica的DMi8倒置荧光显微镜可以达到完美的成像效果。
mRNA捕获&文库构建&测序
1.Visium空间基因表达玻片上各个捕获区域的spatial barcodes是否不同？
在Visium玻片上的4个捕获区域中的每个捕获区域中，都有4992个spatial barcodes，因此用户将需要为每个捕获区域生成一个单独的双端Index文库。
2.同一张玻片上测得的基因表达与不同玻片上测得的结果有何差异？
这个问题并没有直接的答案，因为每张组织切片都是独一-无二的，因此存在一些先天的差异。不过，要让同一玻片上的不同切片或不同玻片上的切片之间的基因表达数据保持一致，最有效方法是通过组织的质量控制。这需要熟练的组织制备和冰冻切片操作。
数据分析
1. 在分析数据时是否需要编程或生物信息学的经验？
通常，研究人员需要具备一点点生物信息学经验来使用Space Range。Space Range流程在Linux服务器上运行；这就需要研究人员了解基本的命令行操作，以及如何登录和退出Linux服务器。不过，在大多数情况下，Space Range是高度自动化的。让软件正常运作的文件和算法都已经包含在内。因此，研究人员只需在测序后将两个输入文件提供给Space Range，让软件生成空间基因表达数据。
Loupe Browser有着完全图形化的界面，并且根本不需要编程。不过，您在研究过程中可能会碰到某个时刻，比如想了解空间基因表达数据的一个具体问题，或者创建一个自定义图形。那么，这就需要您学习R语言或其他脚本编程语言。
2. 我已经对旧版本的空间转录组学（Spatial Transcriptomics）数据进行了测序，可以用Space Range和Loupe Browser来分析这些数据吗？
抱歉，不可以。因为数据类型不同，它们无法兼容。如果您有这种类型的数据，仍然建议您使用现有的处理空间转录组学数据的分析流程。
3. 是否有类似于Seurat的第三方R语言工具来分析空间基因表达数据？
没错！事实上，分析空间基因表达数据的第三方工具的数量正在迅速增长。目前的一些选择包括Spaniel和Giotto。Seurat也是一种选择。Space Range流程的输出矩阵与Cell Ranger的Feature Barcode输出矩阵的格式相同。研究人员可将此输出文件直接输入Seurat中进行进一步的分析。
此外，10x Genomics的计算生物学家还创建了R资源，可以帮助客户对其样本开展深度分析。这些R资源让研究人员能够一次观察多个基因、样本或特征，如基因、UMI和聚类。如果研究人员想分析不同特征的样本，或不同实验条件下的样本（如野生型、患病和治疗中的样本），这可能特别有用。
最后，如果老师们有任何关于Visium空间基因表达解决方案的问题，请联系marketing@accuramed.com，云准科技将提供专业的技术支持和整体服务。
了解更多请点击关注“云准科技”公众号
关于云准科技
云准医药科技（上海）有限公司，成立于 2016 年，是一家专注于组织生物学标记物检测分析、肿瘤创新药物靶点发现及临床病理免疫诊疗检测方案开发的高科技公司。目前我们公司代理 Akoya 的产品（CODEX 平台和 Phenoptics 平台），并基于此可以提供肿瘤免疫微环境检测相关技术服务，以及空间转录组技术服务。最近我们还引进了基因核酸质谱进行基因分型的检测服务。后续我们还会有更多的技术转化，欢迎关注我们，期待与您的合作！上海市徐汇区漕宝路 401 号 3 号楼 1 楼 B 座
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