三级淋巴结构（Tertiary lymphoid structures, TLSs）一直是免疫肿瘤学领域的一个热门话题，它们在影响肿瘤微环境中起着至关重要的作用[1-6]。它们常见于浸润性癌症中，其存在与临床结果的改善相关。虽然TLSs作用的基础机制尚未完全阐明，但普遍认为TLSs是抗肿瘤免疫反应的主要参与者。

TLSs的独特之处在于它们不符合器官的经典定义。它们的结构没有一致的组织方式，也不在预定的位置发生。TLSs出现在组织中，其主要功能与免疫细胞（如胸腺或淋巴结）的产生无关，而是在响应慢性刺激（如感自身免疫和慢性同种异体移植排斥反应）时表现为淋巴样新生。TLSs是抗原呈递和克隆分化的免疫豁免位点，支持免疫记忆[1-4]。

由于TLSs的存在与临床结果的改善有关，因此它们在癌症治疗后的存在或诱导可能是治疗反应的宝贵预测因子。

检测TLSs的最简单的方法是对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的肿瘤组织切片进行苏木色素和曙红（H&E）染色。TLSs以被CD3+ T细胞包围的CD20+ B 细胞结构为主要特征，成熟的TLSs类似于次级淋巴器官（secondary lymphoid organs, SLOs）中的淋巴滤泡，包括次级淋巴器官结构中发现的生发中心的致密细胞聚集体，此外还包含分化程度较低的结构，例如淋巴聚集体和没有生发中心的淋巴滤泡。

然而，H&E和显色IHC染色等方法从FFPE组织切片中提取的信息非常有限。通常，显色IHC被限制在一个或两个蛋白标记物上，这意味着无法完全检查肿瘤微环境中细胞相互作用的全部深度和广度。
 

 

三级淋巴结构的组成
 

多重荧光免疫组化(multiplex immunohistochemistry/Immunofluorescence, mIHC/mIF）的多光谱成像已成为免疫治疗反应重要预测能力的工具。多光谱mIHC/mIF能够更深入地探究肿瘤微环境的空间生物学，包括捕获空间关系的细胞间相互作用[4]。因此，开发临床上有用的生物标志物（如TLSs）来选择免疫治疗的应答者对于推进此类治疗至关重要，mIHC/mIF和空间环境对于TLSs的可靠检测至关重要。

苏黎世联邦理工学院药物科学研究所（IPW）瑞士国家科学基金会（SNSF）PRIMA小组负责人Karina Silina博士最近的发表中，概述了她正在进行的旨在定义TLSs发展在癌症中的生理作用和机制的研究工作。

为了研究癌症中的TLSs发展，她使用了6个蛋白标志物7色的Opal 抗体组合-CD20(B细胞)、PNAD(高内皮小静脉)、 CD3(T 细胞)、DC-LAMP (抗原呈递树突状细胞DCs)、CD23(生发中心细胞，GC)及 CD21（滤泡树突状细胞）。她发现TLSs的发展以逐步的方式发生，并且从淋巴细胞开始聚集在高内皮小静脉周围时开始，以Peripheral-node-addressin（PNAD）表达为标志物。

在早期阶段，TLSs中尚不存在滤泡树突状细胞（FDCs），然后出现可视化FDCs（CD21+）的集群。最后阶段，可见活跃的生发中心（CD21+/ CD23+）。有趣的是，在所有这些已鉴定的阶段中，可以检测到成熟抗原呈递树突状细胞（DC-LAMP+）的存在。她的发现还表明，TLSs的发展在各种组织中看起来相似，包括膀胱，肺，结肠，皮肤，肾脏等等。她所使用的方法是利用mIHC/mIF 来了解 TLSs 作为一种新型免疫治疗方法的潜力。
 

 

用mIHC/mIF进行TLSs定量和成熟度评估
 

越来越多的证据表明，空间生物学是理解免疫治疗反应和临床结果的关键，因此，开发可转化为临床的mIHC/mIF至关重要，TLSs等生物标志物是患者分层的宝贵信息。与H&E染色相比，上面讨论的技术可获得TLSs检测的更高精度[1]。正是这些功能将使研究人员能够全面评估TLSs密度，大小和细胞含量。表征TLSs及其组成的能力是理解持续的适应性免疫反应的关键，它始于获得最清晰的图像。

PhenoImager平台利用Opal染色、高通量多光谱全片图像采集和先进的基于机器学习的图像分析算法来表征肿瘤微环境中发生的细胞水平的免疫生物学。PhenoImager解决方案能够快速准确地对整张切片中的组织进行空间表型分析。这将使研究人员能够在整张切片上开发空间表型特征。空间表型特征的开发需要无偏差的测量肿瘤微环境中肿瘤细胞和免疫细胞的相互作用和细胞密度。将这种技术方法用在TLSs上，我们可以看到将患者分层为特定预后和治疗人群的宝贵潜力。

参考文献

1. Sautès-Fridman, C., Petitprez, F., Calderaro, J. et al. Tertiary lymphoid structures in the era of cancer immunotherapy. Nat Rev Cancer 19, 307–325 (2019).

2. Munoz-Erazo, L., Rhodes, J.L., Marion, V.C. et al. Tertiary lymphoid structures in cancer – considerations for patient prognosis. Cell Mol Immunol 17, 570–575 (2020).

3. Werner, F., Wagner, C., Simon, M., et al. Standardized Analysis of Tertiary Lymphoid Structures in Human Melanoma: Disease Progression- and Tumor Site-Associated Changes With Germinal Center Alteration. Front. Immunol., (2021).

4. Hoyt, C., Multiplex Immunofluorescence and Multispectral Imaging: Forming the Basis of a Clinical Test Platform for Immuno-Oncology. Front. Immunol., (2021).

5. Pagliarulo F, Cheng PF, Brugger L, et al. Molecular, Immunological, and Clinical Features Associated With Lymphoid Neogenesis in Muscle Invasive Bladder Cancer. Front Immunol. (2022).

6. Pimenta EM, Barnes BJ. Role of Tertiary Lymphoid Structures (TLS) in Anti-Tumor Immunity: Potential Tumor-Induced Cytokines/Chemokines that Regulate TLS Formation in Epithelial-Derived Cancers. Cancers (Basel). (2014).
 

 

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