在严重的皮肤损伤后，产生的疤痕组织通常含有致密的细胞外基质（ECM）纤维，没有毛囊（HF）和皮脂腺（SG），缺乏感觉和内分泌功能，也没有正常皮肤的柔韧性，因此在后续的皮肤修复中，刺激HF再生的基本机制是目前迫切需要探索的问题。

2023年9月26日，四川大学华西口腔医学院满毅教授和屈依丽教授团队在Nature Communications发表了题为“Tracing immune cells around biomaterials with spatial anchors during large-scale wound regeneration”的研究，深入探讨了软组织功能性再生过程中免疫图谱的重要性。作者运用单细胞和空间组学技术，详细分析了ECM材料如何激活免疫系统，促进伤口愈合和HF再生。该研究首次揭示了适应性免疫系统在大面积伤口愈合，特别是HF发育激活方面的关键作用。
 

 

研究结果：

1 ECM支架治疗激活特异性免疫应答

作者建立了 ECM_LW组（用 ECM 支架处理的大面积伤口）和 Ctrl_LW组（用生理盐水处理的大面积伤口，无任何生物材料）。ECM_LW 组在术后第 7 天（POD7）的伤口覆盖速度更快，上皮间隙宽度更小，ECM 支架诱导的新生HF以类似胚胎毛囊的发育模式，重现了正常的皮肤结构和同等数量的成熟 HF。相比之下， Ctrl_LW 组从POD 21 开始，伤口中心的新生 HF非常有限。为了探索其潜在机制，作者对在 POD 7 的两组样本（每组 3 个样本）进行了RNA-seq（bulk-seq）分析。结果显示，Ctrl_LW 组 2 型免疫反应活化导致细胞外基质组织过多。而在 ECM_LW 组中，调控 T 细胞发育以及HF再生的 Wnt 和 Hedgehog 信号通路被激活，Gata3 能防止 2 型巨噬细胞炎症驱动的过度胶原沉积，结果说明特异性免疫系统平衡在生物材料刺激下的皮肤再生中发挥着重要的作用。
 

图1 ECM支架治疗伤口愈合过程的评估
 

2 生物材料组织微环境的单细胞图谱

为了进一步了解生物材料处理伤口中的细胞组成，作者分别用POD 7、14 和 21 日从 ECM_LW 和 Ctrl_LW 组的细胞进行单细胞转录组测序（10x scRNA-seq）。根据无监督聚类，作者发现在 ECM_LW 组中，毛囊祖细胞 (HFP1) 和毛囊干细胞 (HFSC1) 的比例更高，这为新生 HFs 提供了充足的上皮资源。接着，作者定义了五个成纤维细胞和两个类成纤维细胞亚群。发现Ctrl_LW 组最初一轮的真皮修复是由下层成纤维细胞系所介导。相反，ECM_LW 组有更多的上层激活状成纤维细胞（PF1）和真皮聚集物细胞（Dermal condensate，Dc1），它们分别与HF生成的启动和形态形成有关。通过对单核细胞和巨噬细胞的亚群进行分析，作者发现促炎巨噬细胞被激活后，表达的促炎细胞因子会诱导抗炎亚群通过表达 TGF-β和各种基质重塑介质，使纤维细胞的活化而导致胶原沉积。ECM_LW 组中与胶原形成相关的亚群-抗炎巨噬细胞（anti-inflammatory macrophages，AIM）持续减少，这表明 ECM 支架在减少2型巨噬细胞浸润中发挥了作用。ECM_LW 组的T 细胞比例较高，说明生物材料诱导了特异性免疫应答。在对 T 细胞进行亚群分析后，作者观察到辅助T细胞（Th21）中多来自于Ctrl_LW 样本，而更多的调节 T 细胞（Treg1）来自 ECM_LW 样本。Th2 细胞可促进 2 型AIM的分化。而Tregs位于正常皮肤 HF 附近的真皮层，可抑制 Th2 介导的成纤维细胞活化和小鼠皮肤纤维化中的瘢痕形成，并且通过Jag1-Notch1 通路促进HF间充质干细胞分化来启动HF再生。Treg1 亚群富集于调控干细胞多能性的信号通路中，揭示了 ECM 支架招募的 Treg1 通过免疫抑制和促进再生功能使HF重新生长。
 

图2 生物材料介导的微环境的单细胞图谱
 

3 生物材料周围的空间异质性

为了探索支架植入伤口中细胞异质性的空间特征，作者用空间转录组测序（10x visium）分析了空间基因表达谱。基因富集分析显示，Ctrl_LW 组富集了与细胞外基质组织、胶原生物合成过程以及抗炎过程相关的基因，表明 Ctrl_LW 组具有典型的 AIM 驱动的纤维化倾向。而ECM_LW 样本拥有与糖酵解过程相关的代谢特征，并且有与T细胞活化和αβT细胞增殖调控相关基因的表达，表明在生物材料介入的微环境中主要存在的是特异性免疫应答。

为了进一步了解单细胞亚簇的空间异质性，作者整合了单细胞和空间转录组的表达信息。结果显示，在 Ctrl_LW 组中，与HF生长相关的PF1仅局限于肉芽组织的上层，而与纤维反应相关PF1的则主要分布在下层。相比之下，ECM_LW 组 与HF生长相关的PF1在生物材料周围的分布更大，表达水平更高，表明 ECM 支架具有促进再生的潜力。此外，ECM_LW 组还有由新表皮层的 HFP 和真皮层下的 Dc 聚集组成的毛胚芽初始结构，这呈现了早期HF形成特征。接着，作者评估了支架诱导的免疫微环境的空间特征，结果显示 AIM1 的减少会减缓成纤维细胞活化和胶原沉积，Treg1 的招募可能有助于抑制由 AIM1 激活的 2 型免疫。
 

图 3 ECM 支架周围细胞分布的空间图谱
 

4 预测生物材料周围空间共定位细胞群之间的关键信号模式

多模态图谱分析表明免疫细胞群和皮肤细胞群之间可能存在潜在的相互作用。接下来，作者用CellChat 预测了 ECM_LW 组和 Ctrl_LW 组细胞间的通讯模式，发现Ctrl_LW 组真皮中的成纤维细胞相互作用信号占主导地位，而ECM_LW 组中生物材料诱导了促进再生的信号。由于 AIM1 可能是导致组织纤维化的主要免疫细胞，作者比较了 AIM1 与成纤维细胞亚群之间的特异性相互作用。在 Ctrl_LW 组中，AIM1 与纤维化成纤维细胞的相互作用更多是通过Tgfbr2+Acvr1b 对靶细胞起着潜在的促纤维化作用。相比之下，在 ECM_LW 组中，Treg1 通过 Jag1-Notch1结合与HF间充质干细胞的相互作用更为显著，这表明 Treg1 在生物材料处理的伤口中具有促进再生的作用。值得注意的是，作者通过 Jag1-Notch2 结合检测到 Treg1 与 促炎巨噬细胞和单核细胞的相互作用更为显著，并在植入的生物材料周围观察到显著的 Notch2 表达。Notch 信号在巨噬细胞极化中起着关键作用，Notch信号的选择性抑制剂可明显抑制M1样巨噬细胞，并上调M2样巨噬细胞，这表明 Tregs 在支架介导的微环境中起抑制作用。
 

图4 免疫细胞和皮肤细胞之间的细胞通讯
 

5 ECM支架介导的皮肤再生需要特异性免疫参与

为了确定特异性免疫应答在HF再生中的作用，作者在缺乏成熟T淋巴细胞的免疫缺陷小鼠（Rag2-/-）的背侧皮肤上放置了 ECM 支架，观察到小鼠的伤口闭合率在 POD7 出现延迟，并且在第 28 天时HF再生稀少。与野生型小鼠（WT）相比，Rag2-/-组小鼠仍具有髓系招募能力，但在生物材料周围没有观察到明显的T细胞聚集。接下来，作者利用 scRNA-seq进一步探讨了WT小鼠和Rag2小鼠之间细胞组成和空间基因表达的差异。发现Rag2组有更多与胶原沉积相关的细胞亚群，招募了更多的单核细胞和巨噬细胞，但是招募T细胞却较少。对T 细胞进行亚群聚类分析后，作者发现抑制性Treg的缺失可能是导致纤维化和胶原沉积失控的原因。接着，作者应用空间转录组测序分析了免疫缺陷小鼠细胞异质性的空间特征，结果显示Rag2 样本毛囊形态发生的基因表达减少，而胶原纤维组织相关基因的表达有所增加。与 WT 样品相比，与HF 相关的细胞群的分布和表达水平降低，但下层的RF2分布和表达水平明显增加。为了比较支架诱导的免疫微环境，作者将免疫细胞的标记基因与空间转录组图谱进行了整合，证实 Rag2 组样本中生物材料周围的 AIM2 聚集从而导致 Treg2 的缺失。
 

图6 免疫缺陷小鼠生物材料周围的细胞微环境空间图谱
 

结论

在这项研究中，作者通过单细胞和空间转录组测序技术首次定义了生物材料介导的伤口愈合过程中微环境的空间异质性，并强调了特异性免疫系统在协调伤口修复方面的促再生作用。这些多模式分析的技术提供了一种独特的介质，通过它作者可以进一步了解ECM支架的免疫调节机制。本次研究证明了由生物材料激活的特异性免疫系统在大面积创伤重建中的作用，并为未来设计用于无疤痕伤口再生的靶向免疫调节材料提供了进一步的见解。

参考文献

Tracing immune cells around biomaterials with spatial anchors during large-scale wound regeneration. Yang Yang, Chenyu Chu, Li Liu, Chenbing Wang, Chen Hu, Shengan Rung, Yi Man* & Yili Qu*. Nat Commun 14, 5995 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-41608-9
 

 

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