细胞焦亡（Pyroptosis），又称细胞炎性坏死，是一种新近发现的不同于细胞凋亡的细胞程序性死亡方式。2001年，Cookson和Brennan最早提出了细胞焦亡的概念，他们在研究中发现了炎症细胞中的一种依赖于Caspase 1的细胞死亡方式，这是一种完全不同于细胞凋亡的死亡方式。与细胞凋亡相比，细胞焦亡发生的更快，并伴有大量促炎因子释放[1]。细胞焦亡的概念提出后，对其机制的研究在很长一段时间内一直没有显著进展。

直到2015年9月，北京生命科学研究所邵峰研究员团队在Nature上发表文章，指出GSDMD在被炎性Caspases切割后释放出来的N端结构域是引发细胞焦亡的重要条件[2]，该研究首次阐明细胞焦亡的关键分子机制。

近年来，相关研究表明细胞焦亡在感染性疾病、神经系统相关疾病和代谢相关疾病等的发生发展有重要影响，对细胞焦亡的深入研究有助于为临床防治提供新思路。对细胞焦亡的研究已成为一个新的热点方向。应用多重免疫荧光技术可以标记细胞焦亡相关细胞的细胞类型和细胞焦亡通路上的重要蛋白分子，将细胞焦亡的研究与组织微环境研究有机的结合起来。

 

应用案例

2022年3月，由中国医学科学院北京协和医学院张建民教授团队在《cells》杂志上发表文章"TSPO Deficiency Exacerbates GSDMD-Mediated Macrophage Pyroptosis in Inflammatory Bowel Disease"。文章中提到的转位蛋白 (TSPO) 是运输胆固醇和卟啉的线粒体膜蛋白，TSPO对于类固醇合成至关重要，可调节线粒体功能和代谢，并在细胞增殖和凋亡中发挥作用。文章发现TSPO缺乏将加剧炎性肠病（IBD）中GSDMD介导的巨噬细胞焦亡。

 

研究结果

1. DSS诱导小鼠肠炎模型发现TSPO敲除后引起更严重的肠炎

研究人员通过DAI分数比较TSPO敲除与野生型小鼠的肠炎严重程度，TSPO敲除（TSPO-KO）小鼠的DAI分数更高，体重降低更明显。对肠组织进行病理染色，发现TSPO-KO小鼠结肠更常出现结肠黏膜糜烂和溃疡、杯状细胞丢失、炎性增生性粘膜细胞团，甚至出现跨壁浸润。

 

 

2. TSPO缺乏导致结肠中促炎性M1巨噬细胞增多

流式细胞检测发现，TSPO-KO小鼠与野生型小鼠在DSS喂养前M1型巨噬细胞比例接近；在DSS喂养10天后，TSPO-KO小鼠和野生型小鼠的结肠中的CD11b+/CD86+M1型巨噬细胞均明显增多，消除小鼠结肠中的M1型巨噬细胞明显高于野生型小鼠。免疫荧光染色对比TSPO-KO小鼠与野生型小鼠，发现敲除小鼠的结肠组织中Iba1+巨噬细胞多于野生型小鼠。

 

 

3. TSPO缺乏促进腹膜巨噬细胞焦亡

WB实验发现，NLRP3, caspase-1, 和 cleaved caspase-1等炎症相关分子的在TSPO-KO小鼠的结肠组织中表达明显高于野生型。但ASCs和GSDMD的表达没有显著差异。这表明TSPO的缺失引起了严重的免疫反应。促炎因子IL-1β在TSPO缺失的小鼠中也明显升高。敲除细胞中炎性小体相关蛋白的上调，表明TSPO参与了相关通路调节，TSPO缺乏导致NLRP3过度激活，这可能是诱导下游焦亡的关键因素。

 

4. TSPO缺乏促进GSDMD诱导的小鼠腹腔巨噬细胞焦亡

WB实验检测细胞中的炎症小体和焦亡相关蛋白，发现与野生细胞相比，敲除细胞中这些细胞裂解物中焦亡相关蛋白caspase-1和ASC的水平显著降低，但caspase-1的P20片段的比例在敲除小鼠中明显升高，这预示着敲除细胞中炎性小体的生成和GSDMD切割作用的增加。焦亡必须蛋白GSDMD (P30)的表达水平也明显提升。作者推测炎症小体相关蛋白表达的减少与细胞焦亡后细胞膜完整性缺失有关，于是作者检测了细胞悬浮液中的这些蛋白的表达水平，发现敲除细胞的这些蛋白在悬浮液中含量显著高于野生型。

从TSPO-KO和野生型小鼠中分别分离腹腔巨噬细胞，通过LPS和ATP刺激诱导焦亡。结果发现KO组的细胞悬浮液中的乳酸脱氢酶水平明显高于野生型对照组，细胞数下降也更加明显。这些结果预示着TSPO缺乏可促进腹膜巨噬细胞在炎症反应早期发生焦亡。

 

5. TSPO通过与线粒体靶向GSDMD相互作用抑制焦亡

为了进一步研究TSPO抑制细胞焦亡的机制，研究人员希望发现在焦亡过程TSPO是否与GSDMD发生了相互作用。研究人员采用Akoya多重免疫荧光的方法检测TSPO与GSDMD在小鼠结肠组织中的共定位。结果显示，DSS处理小鼠结肠组织中存在明显的TSPO和GSDMD共定位。

 

 

随后，研究人员进一步使用共聚焦显微镜观察TSPO缺失细胞在焦亡过程中的动态变化。正常条件下，WT巨噬细胞和TSPO--KO细胞均未见GSDMD的表达；LPS+ATP处理后，TSPO-KO细胞比WT细胞表达了更多的GSDMD。为了进一步验证TSPO与GSDMD之间是否发生相互作用，研究人员用TSPO-GFP质粒转染到293T细胞系中，结果发现，在LPS + ATP处理后，TSPO和GSDMD有特异性共定位，表明TSPO可能在焦亡过程中与GSDMD相互作用。后续Co-IP实验证实了在LPS+ATP处理后，GSDMD信号与TSPO发生了相互作用。

 

 

结论

细胞焦亡是近年来发现的新的细胞死亡方式，它发生在多种免疫细胞中，并与各种疾病的发生发展有着密切的关系。利用Akoya BioScienses的多重免疫荧光完整解决方案，可以帮助用户一次性标记多种相关组织与细胞类型，并同时标记细胞焦亡相关靶标的组织原位表达情况。帮助用户探索不同组织或疾病中，细胞焦亡的组织微环境状态，发现新的致病机理或用药靶点。

参考文献

1. Cookson BT, Brennan MA. Pro-inflammatory programmed cell death. Trends Microbiol. 2001 Mar;9(3):113-4. doi: 10.1016/s0966-842x(00)01936-3.

2. Shi J, Zhao Y, Wang K, Shi X, Wang Y, Huang H, Zhuang Y, Cai T, Wang F, Shao F. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature. 2015 Oct 29;526(7575):660-5. doi: 10.1038/nature15514. Epub 2015 Sep 16.

3. Zhang X, Han J, Xu Y, Cai M, Gao F, Han J, Wang D, Fu Y, Chen H, He W, Zhang J. TSPO Deficiency Exacerbates GSDMD-Mediated Macrophage Pyroptosis in Inflammatory Bowel Disease. Cells. 2022 Mar 2;11(5):856. doi: 10.3390/cells11050856.

 

 

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