肿瘤微环境中MAIT（黏膜相关恒定T）细胞异质性研究又有新进展了！近日，来自美国国立卫生研究院（NIH）的研究团队，在《Cell》杂志上发表了题为“Tumor-associated macrophages trigger MAIT cell dysfunction at the HCC invasive margin”的研究论文[1]。该研究通过多组学联用的方法在肝细胞癌患者样本中检测到MAIT细胞的6个异质性亚群，阐明了肿瘤微环境中TAM影响MAIT细胞活性的机制，进而找出了提高免疫检查点阻断法（ICB）疗效的又一个潜在靶点。

 

 

研究背景

肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是发生于肝脏的恶性肿瘤，在原发性肝癌患者中占比最高（约占85%）。目前认为，HCC的发生与肝炎病毒感染、肝硬化和真菌毒素等引发的慢性炎症相关，属于炎症衍生性癌症。在HCC肿瘤组织内的炎症环境和细胞组成会影响其发生、病理性演进和临床治疗响应程度。研究发现，HCC肿瘤微环境十分复杂，患者间差异显著。多数晚期HCC患者肿瘤微环境内T细胞发生功能性失活（Dysfuction），导致免疫检查点阻断疗法（ICB）临床响应不佳。大量研究致力于通过靶向干预肿瘤微环境中的关键因子逆转HCC微环境中T细胞功能失活来提高ICB疗法的疗效。

黏膜相关恒定T（Mucosal-associated invariant T，MAIT）细胞属于非典型T细胞家族，具有强大的细胞毒活性，且抗原识别不受MHC-I类和MHC-II类分子限制。虽然MAIT细胞在肝脏中广泛存在（占肝脏内T细胞的40%以上），但其在HCC中所扮演的角色尚不明确。一方面，因为MAIT细胞在小鼠肝脏中的比例仅为人肝脏中比例的1%，不利于实验动物研究。另一方面，MAIT细胞在患者间表现出比较显著的异质性，目前尚无系统性研究。

通过单细胞技术绘制细胞图谱（Cell Atlas）能全面地展现组织微环境的细胞组成及其功能状态，是研究微环境中细胞异质性的有力工具。本研究的作者针对MAIT细胞的异质性，设计了加入空间信息的单细胞RNA测序（scRNA-seq），结合PhenoCycler（原CODEX）单细胞空间蛋白组技术，通过建立空间单细胞图谱来研究HCC患者肿瘤微环境中MAIT细胞的异质性。

 

研究思路

作者贴心地在文章补充材料中总结了本研究的技术路线图（图1）。该项目共收集了来自37例HCC患者的肿瘤样本。通过单核细胞富集和细胞分选进行scRNA-seq和流式细胞分析样本的制备，并通过冰冻切片和PhenoCycler（原CODEX）技术完成对应样本的空间蛋白组学检测。整体研究思路采用了高水平研究中常见的单细胞技术（scRNA-seq和流式细胞术）串联PhenoCycler空间蛋白组学检测实现37个靶标检测（抗体选用详见表1）锁定关键机制，再通过体外细胞培养和疾病动物模型进行验证的总体路线。

值得一提的是，作者在进行PhenoCycler空间蛋白分析时和德国图宾根大学团队合作采用了S3-CIMA（supervised spatial single-cell imaging analysis）分析方法[2]，通过弱监督卷积神经网络（weakly supervised convolutional neural network）模型提高空间蛋白组高参数据降维的准确性，锁定了肿瘤边缘组织的巨噬细胞-MAIT细胞相互作用，进而通过MAIT细胞的异质性分布规律找出ICB疗法辅助治疗靶点的设计思路。

 

 

图 1 本研究的技术路线图

表 1 本研究PhenoCycler检测37个标志物抗体列表

 

 

研究过程

1. 通过scRNA-seq确定肿瘤微环境中MAIT细胞的异质性

首先，作者通过scRNA-seq技术检测了从HCC患者手术切除样本单细胞悬液中分选出的CD45+细胞。值得注意的是，研究人员在取样时分别采集了肿瘤中心区（Tumor core）、肿瘤边缘（Rim）和癌旁正常肝（Adjacent liver）组织，进行3个不同来源免疫细胞的scRNA-seq检测。接下来，作者通过细胞基因表达差异进行聚类分析，得到18个免疫细胞簇：9个T细胞簇、1个B细胞簇、1个天然淋巴细胞（innate lymphoid cell）簇、2个DC簇、1个巨噬细胞簇、2个NK细胞簇和2个其他髓系细胞簇（图2A-D）。

为了进一步解析肿瘤微环境中MAIT细胞的异质性，作者对分选得到的MAIT细胞进行聚类分析得到6个不同的MAIT细胞亚群（图2H）。通过22个功能相关基因的表达对比，作者发现6个MAIT细胞亚群中：有4个亚群高表达促炎细胞因子基因、NK相关基因和细胞毒效应相关基因；1个亚群功能失调和耗竭相关基因表达上调；还有1个占比很低的亚群体现为增殖相关基因表达活跃（图2I）。随后，作者用流式细胞技术分别对患者样本和小鼠肝癌模型中采集的样本进行蛋白水平验证，在蛋白水平证实了肝脏肿瘤微环境中MAIT细胞异质性的存在（详见原文结果）。

总的来说，异质性MAIT细胞很难浸润到肝癌的肿瘤中心区域，少数进入到肿瘤中心区域的MAIT细胞则表现出很强的功能失活状态。

 

 

图 2 HCC样本的scRNA-seq检测

 

2. 建立HCC的单细胞空间图谱

为了在空间层面验证细胞技术得到的结果并进一步找出肿瘤内部MAIT细胞功能失活的原因，作者用PhenoCycler空间蛋白组学技术建立了HCC的单细胞空间图谱（37-plex组织全景成像，图3A）。通过原位单细胞表型分析，作者得到了4567421个细胞的空间蛋白表达数据。可以清晰地查看HCC患者从肿瘤中心到癌旁的肝窦结构（图3C①）、门脉三组（portal triads，图3C②）、三级淋巴结构（TLS，）和瘤内新生血管区（图3C④）等的结构细节，并可以实现不同区域中MAIT细胞分布情况及其与其他细胞相互作用情况的分析。

 

 

图 3 HCC空间蛋白组学分析

 

完成HCC样本空间单细胞信息提取后，作者接下来进行空间表型分析。首先对样本中得到的1558175个CD45+免疫细胞进行细胞聚类分析，得到21个免疫细胞簇（图4A-E）。其中，3个B细胞簇、2个NK细胞簇、9个T细胞簇、5个髓系细胞簇和2个其他细胞簇。通过空间表型分析，作者总结出肿瘤中心、肿瘤边缘和癌旁肝脏区域中免疫细胞分布的差异性规律（图4F-H）。而本研究关注的MAIT细胞则呈现出在肿瘤边缘发生显著变化的特点，提示HCC对MAIT细胞功能和活性的调控很可能发生在肿瘤边缘区域。

 

 

图 4 HCC中免疫细胞的空间表型分析

 

3. MAIT细胞功能失活机制研究

将目光聚焦在肿瘤边缘后，作者通过细胞邻域分析和S3-CIMA分析（图4A详细参考文献[2]）获得了各个免疫细胞亚群和MAIT细胞空间相关程度排序表（图4C和4D）。结果显示，高表达PD-L1的TAM细胞（CD163+）在肿瘤边缘区域与MAIT细胞存在最积极的“互动”（图5E）。随后，作者将两种细胞分别分选出来，在Transwell体外细胞培养模型中证实，CD163+巨噬细胞对MAIT细胞的活性抑制作用不仅需要在细胞间接触的前提下完成，还能被PD-L1抗体有效阻断（详见原文）。

 

 

图 5 MAIT细胞-免疫细胞相互作用分析

 

研究到这里，HCC肿瘤组织中MAIT细胞失活的机制呼之欲出。不难预料，本研究的出口再一次指向了那个经典的ICB疗法——aPD1/aPDL1。一系列的肝癌小鼠肿瘤治疗实验后，作者证实靶向TAM能有效缓解MAIT细胞功能失活并提高ICB疗法的效果。

 

总结

除了扎实的结果呈现外，本研究的一大亮点是通过不同组织区域采样使得scRNA-seq检测带有了一定程度的空间信息，增加了单细胞转录组检测的空间维度。当然，作者后续通过PhenoCycler高分辨率的单细胞空间蛋白组检测技术弥补了scRNA-seq技术空间信息呈现方面的不足。本研究建立HCC的单细胞空间图谱并找出了TAM和MAIT细胞的相互作用机制，为提高HCC免疫治疗效果贡献了新的思路。

参考文献

1. Ruf B, Bruhns M, Babaei S, et al. Tumor-associated macrophages trigger MAIT cell dysfunction at the HCC invasive margin. Cell. 2023 Aug 17;186(17):3686-3705.e32.

2. Babaei S, Christ J, Sehra V, et al. S3-CIMA: Supervised spatial single-cell image analysis for the identification of disease-associated cell-type compositions in tissue. Patterns. 2023 4: 100829.

 

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