复旦大学附属肿瘤医院泌尿外科的叶定伟研究团队于2023年12月在《The Journal for ImmunoTherapy of Cancer》期刊上发表名为“Heterogeneity in tertiary lymphoid structures predicts distinct prognosis and immune microenvironment characterizations of clear cell renal cell carcinoma”的文章，该研究对来自两个独立队列的395例透明细胞肾细胞癌（ccRCC）患者的肿瘤组织中三级淋巴结构（TLS）异质性进行了评估，通过多重荧光免疫组化（mIHC）技术量化肿瘤组织中免疫细胞浸润及分布情况，并进一步对TLS异质性对肿瘤预后的影响进行了系统性评估。

 

 

研究背景

 

透明细胞肾细胞癌（ccRCC）是成人肾癌最常见和恶性的组织学形式，占所有肾癌的75%以上。使用免疫检查点抑制剂（ICI）进行免疫治疗，例如CTLA-4 和PD-1抑制剂，在抑制 ccRCC的进展、复发和转移方面显示出有希望的结果。然而，ccRCC 的特征是高度异质性，导致不同的治疗敏感性和预后。因此，筛选和鉴定用于预后预测、治疗选择和治疗效果的有效生物标志物对ccRCC 的诊断和管理提出了重大挑战。

 

三级淋巴结构 （Tertiary lymphoid structures，TLS） 是出生后在非淋巴组织中发育并与病理状况（如慢性炎症、肿瘤等）相关的免疫细胞的有机组织聚集体。TLS通常含有B细胞滤泡，并被T细胞和树突状细胞包围。肿瘤微环境（TME）中的三级淋巴结构 （TLS） 在促进免疫细胞浸润到肿瘤微环境中起着至关重要的作用。因此，TLS作为免疫治疗和患者预后指标的潜在介质而受到广泛关注。

 

本研究通过分析ccRCC微环境的免疫细胞组织而衍生的生物标志物的潜力具有重要意义。

 

 

研究方法

1. TLS定位评估：

通过至少一次H&E切片来识别TLS定位，由一名泌尿外科医生和两名病理学家独立进行。

 

2. TLS成熟度评估：

通过多重荧光免疫组化（mIHC）技术评估肿瘤微环境中TLS的成熟度。

 

 

研究结果

1. ccRCC中TLS定位异质性的特征

在这项研究中共纳入两个研究队列，包括来自复旦大学附属肿瘤医院（FUSCC）的训练队列（n=290）和来自外部的验证队列（n=105）。首先对来自两个独立队列的395例ccRCC 患者的诊断样本进行 H&E 染色，分析临床病理特征来评估TLS的有/无和定位。结果发现，在34.2%的ccRCC样本中检测到TLS浸润。在TLS阳性病例中分别有37.8%、74.1%和11.9%的TLS分别位于肿瘤近端、肿瘤远端或两者兼而有之。

 

该研究显示，肿瘤近端TLS的存在与长期生存率的改善和抑制疾病进展相关。相反，肿瘤远端TLS阳性与长期生存率低和疾病进展显著相关。

 

 

2. ccRCC中TLS成熟度异质性的特征及对ccRCC预后的影响

成熟的三级淋巴结构（TLS）含有CD3+ T细胞、CD20+滤泡B细胞、CD21+ 滤泡树突状细胞（FDC）和CD23+ 生发中心细胞（GC）。类似于次级淋巴器官滤泡，TLS根据成熟度不同可分为三个发育阶段：E-TLS（早期TLS）、PFL-TLS（初级滤泡样TLS）和SFL-TLS（次级滤泡样TLS）。

 

在TLS整个发育过程中都可检测到DC-LAMP（成熟抗原呈递 DC），其浸润与临床结局改善有关。使用7色荧光免疫组化技术（mIHC）探索了不同成熟阶段TLS中DC-LAMP（成熟DC）的丰度。此外，发现肿瘤远端TLS簇中E-TLS的比例显著较高，而肿瘤近端TLS簇主要是SFL-TLS。

 

 

TLS成熟阶段可能是导致TLS定位差异和疾病预后关联混杂因素。SFL-TLS的存在与更好的临床结局显著相关。对来自复旦大学附属肿瘤医院（FUSCC）的训练队列290例 ccRCC 患者进行了 PFS 和 OS 的单因素 Cox回归分析，显示SFL-TLS的存在与进展风险降低和生存期延长之间存在显著关联。

 

 

3.肿瘤近端 TLS 列线图预测 ccRCC 预后

使用FUSCC训练队列进行多变量Cox回归分析，建立了一个列线图（nomogram）来预测2年、5年和8年PFS的概率。肿瘤近端TLS相关的高风险评分与侵袭性PFS显著相关，时间相关ROC曲线的AUC值>0.80，提示预测PFS的列线图具有较高的敏感性和特异性。

 

此外，预测OS的列线图风险评分升高与较短的OS显著相关，时间相关ROC曲线的AUC值表现出较好的判别能力。在外部验证队列也获得了一致结果。上述发现共同证明了肿瘤-近端TLS在ccRCC患者中的敏感性和独立预后能力，并强调了肿瘤近端TLS列线图的显著预测性能，能够识别长期肿瘤复发高风险和临床预后差的患者。

 

 

4. 通过mIHC 评估TLS成熟度和细胞组成异质性

既往研究已观察到TLS成熟度与癌症之间关系的异质性，提示潜在的预后影响。因此，更全面地了解TLS的异质性，包括细胞组成、位置、成熟度及其对抗肿瘤免疫反应的影响，将是有临床预测价值的。在本研究中，使用多重荧光免疫组化（mIHC）技术，共设计了两个7色Panel，搭配Akoya Biosciences 7色自动化免疫组化试剂盒一起使用，对58例ccRCC组织的TLS异质性进行了表征。

 

mIHC 7色Panel详情：

 

对TLS成熟阶段细胞组成的分析揭示了TLS的异质性（详见下图）。有趣的是，在低倍视野下可观察到E-TLS和SFL-TLS在同一位置彼此相邻；然而，它们的外部轮廓结构和内部细胞成分有明显差异。

 

最后，选取一组不同TLS定位和成熟阶段的患者，检测参与TLS发育的细胞成分及其对TME免疫状态的预测价值，并评估TLS内淋巴细胞丰度和ccRCC肿瘤免疫逃逸情况。将inForm图像分析软件与PhenoImager HT多光谱成像分析系统配合使用，获得高信噪比（扣除背景自发荧光）的图像，并进行准确的批量定量分析，提供每个细胞中各种生物标志物的准确定量，并分析特定细胞类型在DAPI+细胞数量中的百分比。通过对所得数据进行非分层聚类分析，生成热图，可视化CD8+ T细胞和其他免疫细胞浸润在肿瘤近端和肿瘤远端区域的比例。这种对TLS异质性的观察为理论基础提供了有价值的间接证据，并解决了与预后效应相关的因果关系问题。

 

 

 

总结

本研究首次阐明了TLS定位和成熟度异质性对ccRCC不同临床结局的影响。该研究采用多重荧光免疫组化（mIHC）技术对TLS不同成熟阶段的免疫细胞组成异质性进行表征，强调了TLS异质性的预测价值，与ccRCC的进展和免疫治疗反应有关。这些发现有助于识别免疫表型并改进ccRCC管理中的免疫治疗干预措施。

 

 

参考文献

1. Xu W, Lu J, Liu WR, Anwaier A, Wu Y, Tian X, Su JQ, Qu YY, Yang J, Zhang H, Ye D. Heterogeneity in tertiary lymphoid structures predicts distinct prognosis and immune microenvironment characterizations of clear cell renal cell carcinoma. J Immunother Cancer. 2023 Dec 1;11(12):e006667. doi: 10.1136/jitc-2023-006667. PMID: 38040418; PMCID: PMC10693897.

    

   

    

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