胸腺组织再生能力研究再下一城。研究人员通过单细胞空间多组学技术详细地定义了胸腺组织中的异质性上皮细胞亚群，并首次证实胸腺组织中存在一种具备自我再生、多潜能分化和组织重构能力的干细胞。该项研究由伦敦弗兰西斯-克里克研究所（The Francis Crick Institute）的科研团队完成，并于近期发表于《Development Cell》（IF=13.417）杂志上[1]。该团队的发现不仅能帮助我们理解胸腺微环境中上皮细胞的分化和调节机制，还为解决胸腺萎缩及相关疾病奠定了基础。

 

 

 

研究背景

胸腺是人体重要的中枢免疫器官之一，位于胸骨柄后方紧靠心脏的前纵隔上部，不仅为T淋巴细胞发育和成熟提供场所，也能通过分泌胸腺肽进行内分泌调节。胸腺由不对称的左、右两叶构成，在新生儿期到青春期缓慢发育增大，成年后开始逐渐萎缩，且实质区域被脂肪组织所代替。胸腺呈多层组织结构，表面覆盖结缔组织被膜，延伸至里层胸腺实质并将胸腺划分为未完全隔开的小叶，小叶浅层是皮质（cortex），深层是髓质（medulla）。

 

胸腺上皮细胞（thymus epithelial cell，TEC）是胸腺皮质和髓质中重要的基质细胞，不仅有组织结构支架的作用，还能参与胸腺细胞分化、发育和T细胞成熟过程。胸腺上皮细胞因其分布位置不同又可以分为皮质胸腺上皮细胞（cTEC）和髓质胸腺上皮细胞（mTEC）。早期胸腺祖细胞（Early Thymic Progenitor）在胸腺中发育成熟为初始T细胞（naive T cell）。过程中，要先后经历在胸腺皮质中完成的阳性选择（主要由cTEC参与）以及在髓质中完成的阴性选择（主要由mTEC和树突细胞参与）。

 

虽然有研究表明胸腺萎缩是一个可逆的现象，但在本研究发表前，尚无证据表明胸腺组织内有可以支持组织再生的干细胞。本文作者所在团队长期从事胸腺发育和胸腺细胞异质性相关研究，并于近期成功从胸腺组织中分离了可以通过体外培养进行扩增的CD49f+（ITGA6）的TEC[2]。为了更深入地了解胸腺中的细胞异质性并寻找能实现胸腺组织重建的干细胞，作者以单细胞测序为出发点展开了该项研究。

 

 

研究思路

本文中，分选、测序分析和体外培养技术的巧妙结合应用为研究增色不少。在单细胞测序前，作者通过细胞分选完成TEC的富集，成功解决了胸腺组织中TEC细胞比例少的技术难题，获得了更高的测序通量。随后，作者利用单细胞测序（scRNA-seq）技术研究胸腺组织中上皮细胞的异质性和分化路径解析。再通过空间分析技术（空间转录组和PhenoImager多重荧光免疫组化）完成组织微环境分析。最后，结合体外培养和细胞学分析技术完成干细胞分化的体外验证。

 

 

研究过程

1. 通过scRNA-seq确定胸腺上皮细胞的异质性

首先，作者通过scRNA-seq技术检测了从胸腺组织中分离并二次富集的TEC（分别分选EpCAMlow/CD205+的cTEC和EpCAMhigh/CD205-的mTEC）。结果显示，从胸腺组织中分离并富集得到的TEC中有16个细胞亚群（图1A）。其中，有4个cTEC基因特异性表达的TEC亚群（TEC I、TEC II、TEC III亚群和TEC-IEG，其中TEC-IEG是本研究首次发现）和7个mTEC基因特异性表达的TEC亚群（作者根据细胞中组织相关基因的表达情况将这7个亚群分为5类：TEC-肌样、TEC-离子细胞样（Io）、TEC-胸腺小体样、TEC-神经内分泌和TEC-机械）。

 

另外，还有两个亚群的TEC不仅表达cTEC和mTEC标志角蛋白，还表现出多种组织上皮细胞的角蛋白特征，作者将其命名为PolyKRT细胞。其中一个PolyKRT亚群的细胞表现出更活跃的增殖能力和全克隆相关的基因特征（提示其可能具有干细胞特性），作者将其命名为增殖PolyKRT细胞。

 

 

图1 胸腺TEC的scRNA-seq检测

 

为了进一步明确胸腺组织中各个亚群TEC的分化路线，作者进行了分化轨迹分析（图2）。分化轨迹（时间模拟）图从基因表达角度展示了PolyKRT细胞向cTEC和mTEC的分化情况。并确定了两个分化中的TEC细胞亚群（mTEC-differ和cTEC-differ）。值得一提的是，在mTEC中，除了mTEC-lo外亚群外（直接分化途径），所有mTEC亚群都由共同祖细胞分化而来。

 

 

图2 胸腺TEC分化轨迹（时间模拟）图

 

 

2. 空间多组学方法解析PolyKRT细胞的组织微环境

为了研究PolyKRT细胞的在胸腺组织中的分布情况，作者用空间原位检测技术对样本进行空间表型分析。在确定了PolyKRT细胞的基因表达标志物（FN1、BCAM、LIFR和IFITM3）后，作者将在scRNA-seq和空间转录组中均检测到的BCAM（LAMA5受体）作为定义PolyKRT特征的标志基因。多重荧光免疫组化检测结果证实了胸腺组织中PolyKRT细胞在皮质和髓质内的囊下（SCap）和血管周围区域募集。

 

 

图3 胸腺PolyKRT细胞的空间表型分析

 

 

3.  确定PolyKRT细胞是胸腺组织中的上皮干细胞

接下来，为了确认胸腺组织中PolyKRT细胞的干细胞特性，作者对胸腺组织中分选出来的4类细胞（BCAM+的cTEC、BCAM-的cTEC、BCAM+的mTEC和BCAM-的mTEC）进行干细胞克隆集落培养检测。结果显示，来自cTEC和mTEC中的BCAM+细胞均能形成可以传代培养的克隆细胞团（图2B）。随后，作者对新分选出的BCAM+和BCAM-TEC细胞进行基因表达分析。结果表明，皮质标志物（CTSV、FOXN1、PSMB11、SCX和LY75）和髓质标志物（CCL21、EpCAM、CLDN3和CLDN4）在cTEC和mTEC来源的BCAM+细胞中均有表达（图2和文章补充材料）。此外，这些细胞中还检测到了与PolyKRT细胞相同的角蛋白表达多样性（KRT5、KRT13、KRT14、KRT17和KRT18）。

 

 

图4 PolyKRT细胞亚群的克隆集落分析

 

为了进一步验证PolyKRT细胞上皮干细胞的特性，作者将PolyKRT细胞的测序数据与表皮衍生的克隆原干细胞（如皮肤角质形成细胞）的测序数据进行对比分析。scRNA-seq分析结果表明，表皮衍生的克隆原干细胞与PolyKRT细胞在增殖、细胞运动和ECM调节等相关分子表达上的转录水平重叠程度非常高。对体外克隆培养PolyKRT细胞得到的单个克隆球进行表型检测，结果表明PolyKRT细胞来源的克隆球不但可以分化出cTEC和mTEC的表型，甚至其中的CD90+细胞还能重建出胸腺中多个表型的细胞。这些结果证实了PolyKRT细胞是胸腺组织中的干细胞。

 

 

图5 PolyKRT细胞的干细胞特性分析

 

 

4. 验证胸腺上皮干细胞组织分化能力

最后，作者利用该团队开发的体外培养组织分化实验对PolyKRT细胞的分化能力进行研究。在没有其他基质细胞和造血细胞的分化体系下，PolyKRT细胞可以向多种上皮组织分化。多重荧光成像结果显示，样本中可以检测到明显的HB样区域（KRT10+），稀疏Io样区域（KRT7+），髓质祖细胞（ASCL1+）和肌样细胞（DES+）（图6B-6D）。不仅如此，如果在单PolyKRT细胞组织培养体系下加入造血干细胞等其他干细胞，体外培养体系下可以形成与人体胸腺组织相似的组织结构，甚至能进一步重建出皮质和髓质组织结构（图6E-G）。这个结果不仅证实了PolyKRT细胞的组织分化能力，还进一步说明单个PolyKRT细胞也具备多区域的组织重建能力。

 

 

图6 PolyKRT细胞的组织重建能力检测

 

 

总结

这项研究在胸腺再生研究领域内无疑是里程碑式的突破。本文作者在一次采访中提到：“虽然胸腺是一个随着年龄增长而缩小的器官，但胸腺组织内干细胞的再生能力却不亚于皮肤干细胞。本研究的发现暗示着胸腺在成年后仍发挥着更多超出现有认知的重要功能”。相信本研究的发现能为后续的胸腺萎缩治疗、免疫系统强化、肿瘤免疫改善等相关临床转化方向带来新的视角。

 

 

参考文献

1. Ragazzini R, Boeing S, Zanieri L, et al. Defining the identity and the niches of epithelial stem cells with highly pleiotropic multilineage potency in the human thymus. Dev Cell. 2023 Aug 28:S1534-5807(23)00413-6.

2. Campinoti S, Gjinovci A, Ragazzini R, et al. Reconstitution of a functional human thymus by postnatal stromal progenitor cells and natural whole-organ scaffolds. Nat Commun. 2020 Dec 11;11(1):6372. doi: 10.1038/s41467-020-20082-7.

 

 

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