前列腺癌是一种广泛的异质性疾病，肿瘤微环境具有复杂的细胞生态系统。然而，前列腺癌肿瘤细胞如何与基质细胞互作介导其异质性则知之甚少。复旦大学附属肿瘤医院泌尿外科/复旦大学肿瘤研究所团队通过10x Genomics单细胞转录组测序联合Visium空间转录组技术进行全面研究，分析了随疾病进展的阶段特异性前列腺癌微环境的异质性，有助于加深对前列腺癌的理解以及诊断和治疗。

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文章题目：Integration Analysis of Single-Cell Multi-Omics Reveals Prostate Cancer Heterogeneity

中文题目：单细胞多组学整合分析揭示前列腺癌异质性

发表期刊：Advanced Science

影响因子：15.1

发表时间：2024年03月14日

发表单位：复旦大学附属肿瘤医院泌尿外科/复旦大学肿瘤研究所

云准提供的技术服务：10x单细胞5'转录组测序，Visium空间转录组测序及信息学分析服务

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文章摘要：

 

前列腺癌(PCa)是一种广泛的异质性疾病，肿瘤微环境(TME)具有复杂的细胞生态系统。然而，肿瘤和基质细胞形成异质性的方式仍然知之甚少。在本研究中，对PCa患者和健康对照者的单细胞RNA测序、空间转录组学和Bulk ATAC-seq序列进行了整合,发现了SOX9highARlow表达的club细胞的一个干性亚群，该亚群在新辅助雄激素剥夺治疗(ADT)后显著富集。作为效应T细胞的CD8+CXCR6+ T细胞亚群在恶性PCa患者中显著减少。在空间转录组分析中，综合利用机器学习和计算智能来识别前列腺癌细胞的细胞多样性和细胞间的原位通信，巨噬细胞和中性粒细胞状态的转变沿着癌症进展的轨迹也进行了检查。最后，发现晚期前列腺癌的免疫抑制微环境与调节性T细胞(Tregs)的浸润有关，可能由FAP+成纤维细胞亚群诱导。总之，在单细胞分辨率下，在特定阶段的前列腺癌微环境中描述了细胞异质性，揭示了它们与疾病进展的相互串扰，这有助于促进前列腺癌的诊断和治疗。

 

实验设计：

 

本研究从7名PCa患者（其中6个局部PCa 样本、1个神经内分泌前列腺癌样本）与1名正常样本，用10x Genomics 单细胞5，转录组学和配对空间转录组学与PCa进展过程中Bulk ATAC-seq染色质可及性的研究，揭示了上皮异质性，并确定了可能导致前列腺癌复发的潜在亚型，探讨了上皮-免疫细胞/间质细胞通讯的影响及关键调控调节途径决定疾病进展。

 

研究结果：

 

1、上皮细胞、淋巴细胞和髓细胞是前列腺癌微环境中的主要细胞类型

为了解前列腺癌标本中细胞组成和转录状态的多样性，作者对根治性前列腺切除术(RP)标本中的6个局部PCa (PCa-2-7)样本、1个神经内分泌前列腺癌(NEPC)样本(PCa-1)和1个正常前列腺(PCa-8)样本进行了10x 单细胞（scRNA-seq）测序和 Visium 空间转录组测序，用H&E和免疫组化(IHC)染色来鉴定PCa的病理类型，总共分析了77661个细胞，并鉴定了9种不同的主要细胞类型，以特定的基因表达谱为标志（图1A-E），合并数据集中的细胞并做了注释。结果表明除了正常对照外，上皮细胞构成了所有样本中的主要细胞类型。

图1.PCa微环境的研究设计

 

2、上皮细胞亚群异质性与癌症上皮的演化

作者通过10x scRNA-seq和 Visium stRNA-seq数据分析KRT8 和 KRT18的表达鉴定上皮细胞（N=32741），将它们分为11个亚群。发现管腔上皮细胞高度异质性，每个集群主要来源相应的患者（图2A-C），并对每位患者的H&E染色进行了Gleason评分，评估显示为1个典型的经内分泌前列腺神癌（NEPC）（PCa1），前列腺癌（PCa-2-7）和正常供体（PCa-8）的Gleason评分范围为6-9之间（图2D）。

Visium stRNA-seq 数据分析显示NEPC患者强烈表达CHGA和SYP，而CRPC的独特标志物AMACR (p504s)和KLK12在CRPC患者中明显较高(图2H)，H&E染色显示大部分PCa-6上皮为“正常上皮”，scRNA-seq数据分析约20%的PCa-6上皮细胞与癌症细胞非常相似，另一个管腔上皮细胞亚群显示出与正常上皮细胞相似的转录组，但它们也具有神经肽Y（NPY）的特征性增益表达。随后，作者将该聚类注释为“正常样上皮”亚群，发现其主要出现在Gleason评分（GS）较低的患者中。这些结果表明，转录组变化可能发生在明显的前列腺癌组织学模式发展之前。估计拷贝数变异（CNV）分析和z-score评估，作者对上皮亚群命名“正常” “正常样” 和 “肿瘤”。

使用Bulk ATAC-RNA测序发现随着PCa的进展，AR靶基因(如KLK2、KLK3和FKBP5)的转录激活发生显著变化，CRPC患者在KLK11和AMACR位点有更多可接近的染色质（图2I，J），并进一步进行验证。

这些结果连同作者的发现，揭示了前列腺癌进展的上皮细胞的异质性。

图2.上皮细胞亚群异质性，癌症上皮细胞的染色质可及性变化

 

3、靶向治疗产生独特的SOX9高干细胞样状态上皮细胞

作者对上皮亚群进行了伪时间细胞轨迹分析发现SOX9HighKLF5+club细胞群（club细胞1）主要在接受ADT（PCa-4）的患者中富集（图3E），并进行了验证。

接着分析表明ADT诱导管腔细胞死亡，但对club细胞几乎没有影响。此外通过IHC染色分析残余形态上“正常”的细胞以AR－为特征，但MMP7和LTF高表达，确认是club细胞，且在ADT暴露期间，club细胞比例显著增加。Visium stRNA-seq数据证实ADT治疗患者中的大多数上皮细胞是club细胞（图3F，G），伪时间轨迹分析表明SOX9和KLF5过激活可能是正常腔细胞去分化为肿瘤干细胞的驱动因素，MYC可能是另一种促进腔细胞向癌上皮细胞分化的加速器(图3J)，GO表明SOX9Highclub细胞具有一定的干性特征或启动转移的倾向(图3K)。

这些结果表明在ADT后，残留的细胞类型具有干细胞样状态，可能与PCa复发有关。

图3.靶向治疗产生独特的SOX9High干细胞样状态上皮细胞

 

4、绘制肿瘤浸润淋巴细胞图谱并鉴定 PCa 微环境中的效应 CD8+T 细胞亚群

前列腺癌被认为是免疫原性较差或“免疫沙漠”，缺乏免疫浸润。但是scRNA-seq数据分析表明T细胞在所有细胞类型中排名第二（图1C）。作者重新分析了T细胞亚群发现大多数浸润性淋巴细胞是CD8+T淋巴细胞（图4B，E），在PCa微环境中，CD8A和CXCR6在TCGA-PRAD队列中呈正相关(Pearson相关系数R = 0.82)，随着PCa的进展，CD8+T细胞逐渐失去CXCR6的表达(图4J-L)，表明CXCR6的表达对CD8+T细胞存活和细胞毒性至关重要，Monocle2进行了伪时间分析CD8+T细胞的分化过程，热图揭示了CD8+T细胞的连续转变。流式细胞术结果表示CD8+CXCR6+淋巴细胞可通过细胞毒性颗粒蛋白介导靶细胞死亡。

因此，CD8+淋巴细胞中的CXCR6缺失可能加速癌症的进展。

图4.PCa微环境中的效应CD8+T细胞亚群鉴定

 

5、PCa特异性肿瘤相关巨噬细胞TAM-Macro-2，ADT诱导具有潜在抗癌活性的IL1B-NLRP3巨噬细胞

髓细胞构成PCa微环境中第二大免疫细胞群体。重新分类的髓系细胞通过scRNA-seq分为7种细胞类型，IL1B-NLRP3和S100A9+巨噬细胞分别在PCa-4和PCa-6患者中富集（图5D），发现了一个新的巨噬细胞亚群，作者称之为“TAM Macro-2”，其特征是缺乏CD86和CDKN1A的表达，不分泌T细胞趋化因子，富集分析表明TAM Macro-2促进了癌症的侵袭，提示IL1B-NLRP3 Macro潜在的抗癌活性作用。肿瘤细胞可能劫持CD68+CD86−抑制免疫反应以促进肿瘤生长。此外发现SIRPA（分子CD47配体)在MRC1+TAMs中过度激活，并在大多数肿瘤浸润的巨噬细胞上表达，这表明巨噬细胞是PCa微环境中肿瘤免疫监视的重要介质。

另外，还研究了T细胞与其他细胞类型的空间共定位，反卷积结果表示，与上皮细胞相比，免疫细胞之间的距离更近，表明免疫细胞之间的细胞通讯被激活，从而促进或抑制免疫反应。

图5.PCa特异性肿瘤相关巨噬细胞亚群

 

6、肿瘤内中性粒细胞的两种不同状态的冲突功能

中性粒细胞是人类血液中最丰富的髓系细胞，其浸润PCa微环境的水平较低，作者将瘤内中性粒细胞亚群区分为“活化中性粒细胞”或“过敏的中性粒细胞“（图6A–C），活化的亚群可能通过MHC II类分子和免疫细胞募集具有抗原呈递。通路富集分析表明，活化的中性粒细胞中表达的基因主要参与抗原加工、通过MHC II类分子呈递外源肽抗原以及调控趋化因子的产生，过敏的中性粒细胞在肿瘤中起促进作用。此外，活化的中性粒细胞与肺腺癌（LUAD）的良好预后有关，可能发挥抗肿瘤作用，在过敏的中性粒细胞KIRC、胃腺癌（STAD）和LUAD等几种肿瘤类型的预后不良有关。

表明活化的中性粒细胞可能发挥抗肿瘤作用，而过敏的中性粒蛋白在前列腺癌中的作用从保护性变为潜在的促肿瘤作用。

图6.肿瘤内中性粒细胞的两种不同状态

 

7、成纤维细胞亚群异质性的作用

成纤维细胞可以通过促进血管生成、调节肿瘤免疫和调节化疗耐药性来调节肿瘤的进展。来自PCa成纤维细胞的scRNA-seq数据显示，基于独特的胶原蛋白库和其他细胞外基质(ECM)分子的表达，有五种不同的细胞类型。细胞外基质组织(ECM)途径是PDGFRA+和POSTN+CTHRC1+FAP+ Fibro最常见途径，通过分析表明FAP和/或PDGFRA激活的成纤维细胞可能是不同情况下肿瘤微环境重塑的结果。

在NEPC样本中，浸润的T细胞是Treg细胞(图4E)，提示可能POSTN+CTHRC1+FAP+ Fibro促进Treg存活和/或分化(图7I)。并进一步进行了验证，表明FAP+成纤维细胞可能通过创造一个促进化疗或放疗耐药的生态位来促进PCa的进展。

图7.表征成纤维细胞亚群的异质性

 

总结：

 

在这项研究中，作者收集不同Gleason 评分的PCa患者和健康对照组前列腺组织，通过整合单细胞、空间转录组和bulk ATAC测序，鉴定了一群SOX9HighARLow的干细胞亚群，该亚群在雄激素剥夺治疗（ADT）后显著富集，通过分子生物学实验，作者初步揭示了这群细胞可能是PCa ADT耐药复发的潜在起源。此外，作者还深入探究了PCa免疫微环境随着Gleason 评分的变化，发现恶性PCa患者其效应T细胞亚群（CD8+CXCR6+T）数目显著减少。同时，巨噬细胞以及中性粒细胞在不同病理状态下，其功能会发生明显转变。作者还揭示了一群FAP+成纤维细胞亚群，通过诱导CD4T-Treg分化而介导肿瘤微环境免疫抑制。简而言之，作者以单细胞分辨率描绘了随疾病进展的阶段特异性PCa微环境的异质性，这些结果将有助于加深我们对PCa的理解以及诊断和治疗。

 

 

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